В 1591 году на месте нынешней обители находился «обоз» – военный лагерь русских войск, готовившихся к обороне Москвы от крымского хана Казы-Гирея. Стремительная победа  над ним была воспринята как чудо. В лагере находилась Донская икона Божией Матери, и именно в ее честь и в память о победе над крымцами в 1593 году был создан монастырь. В Смутное время обитель была разграблена и пришла в упадок, в конце XVII века возродилась и в целом приобрела нынешний облик.

Первый собор Донской иконы Божией Матери был построен в 1593 г. Его конфигурация в виде одноглавого куба с алтарными апсидами и горкой кокошников в дальнейшем стала образцом для храма Покрова в Рубцове, Казанского собора на Красной площади и других церковных построек. Предположительно автором проекта был Федор Конь – создатель стен Белого города в Москве и укреплений Смоленского кремля. В 1679 г. к собору была пристроена трапезная и шатровая колокольня.

В 1684–98 годах по обету сестры Петра I, царевны Екатерины Алексеевны, возведен второй собор, тоже Донской иконы Божией Матери, получивший название Большого. Поставленный на высоком подклете, он создан четырехлепестковым в плане, причем каждый выступ увенчан своей главой. Это редкий для Москвы случай, когда главы собора расставлены по сторонам света. Полностью сохранилось убранство: восьмиярусный иконостас, созданный мастерами Оружейной палаты, и росписи кисти Клаудио. Тогда же на пожертвования семьи Кирилловых создана каменная ограда с двенадцатью башнями.

Над северными вратами в 1713–14 годах вдовой царя Ивана V возведена Тихвинская церковь, над западными в 1750–53 годах – колокольня с церковью святых Захария и Елисаветы, в юго-западной части построена больница и другие здания. Позже создавались фамильные церкви-усыпальницы: князья Голицыны в 1809 году построили при больнице храм Архангела Михаила, над могилами Зубовых в 1796–98 годах появилась церковь-ротонда во имя Александра Свирского, в 1888–1891 годах в псевдовизантийском стиле возведена церковь Иоанна Златоуста с усыпальницей Первушиных, в 1898 генерал-майор Терещенко создал фамильную церковь Иоанна Лествичника.

В 1920-х в монастыре продолжались богослужения, но отдельные здания передавались под советские учреждения и жилье. В 1922–25 годах здесь содержался патриарх Тихон. В 1934 году вся территория перешла в ведение Музея архитектуры. Это позволило сохранить уникальный ансамбль и создать на его основе архитектурный заповедник. Вдоль его северной и восточной стен разместили фрагменты разрушенных в 1920-30-х годах памятников: часть мраморных горельефов Храма Христа Спасителя, оконные наличники Сухаревой башни, портал церкви Успения на Покровке, окно из затопленного Калязинского монастыря на Волге и т.д.

Кладбище Донского монастыря оказалось единственным монастырским некрополем Москвы, не уничтоженным после революции. Сюда свозили некоторые надгробия из других храмов и монастырей. С 1946 года действовал только Малый собор. В Большом была музейная экспозиция, малые церкви приспособили под библиотеку, архив и фондохранилища. Церковь Иоанна Златоуста при этом полностью утратила интерьер.

Возрождение монастыря началось с 1991 года, вскоре после его открытия обретены мощи патриарха Тихона. Богослужения проводятся постоянно в Большом соборе, остальные церкви открыты нерегулярно. На месте бывших братских огородов построено две новых небольших церкви: в честь патриарха Тихона и во имя Георгия Победоносца.

В 2014-2016 гг. была проведена реставрация малого собора. Реставраторы заменили поздние конструкции крыш объемов трапезной, приделов и собора на новые — исторических форм. Проведена реставрация металлического креста середины XVIII века с прорезными деталями, а также крестов на колокольне и главах приделов. Фасады были окрашены в цвет, обнаруженный при натурном обследовании. Самой важной и сложной частью реставрации стало воссоздание растесанных окон XVI века.

Жюри конкурса "Московская реставрация-2016" по достоинству оценило проделанную работу, монастырь стал лауреатом сразу двух номинаций.