Церковь святителя Николая Чудотворца, епископа Мирликийского, в Толмачах стоит на углу Большого и Малого Толмачёвских переулков. Эти названия напоминают о том, что здесь, на окраине старинной Кадашёвской слободы, некогда существовала небольшая слободка переводчиков-толмачей. Неизвестно, когда именно на этом месте появился первый деревянный храм. Во время реставрационных работ был найден фрагмент надгробия, датированного 1544 годом. Однако первое упоминание о церкви Николы Чудотворца с приделом Иоанна Предтечи «что за Москвою-рекою в Толмачах» в книгах патриарших приказов относится лишь к 1625 году.
Каменное здание церкви было возведено в 1690-х годах, о чем свидетельствуют надписи на иконах, созданных для этого храма мастерами Оружейной палаты. Одна из икон была написана в 1692 году, другая — в 1697 году. Заказчиками икон были богатые «гости»-кадашевцы, отец и сын –— Кондратий и Лонгин Добрынины. Тогда же на средства отца и сына Добрыниных строилась величественная церковь Воскресения Христова в Кадашах (1687–1695). Вероятно, они же оплатили строительство более скромной церкви в Толмачах.
Стройный четверик храма увенчан декоративным пятиглавием и перекрыт внутри сомкнутым сводом. Окна, расположенные в два ряда, украшены наличниками с полуколоннами и тимпанами в виде разорванных фронтонов с «гирьками». Фасады над карнизом завершены кокошниками с «раковинами», но храм изначально имел четырёхскатную кровлю. Некогда с западной стороны к церкви примыкала одностолпная трапезная с приделом и колокольней.
Иконы для храмового иконостаса были выполнены мастерами Оружейной палаты. Из них сохранились четыре иконы местного ряда: «Христос Вседержитель», «Богоматерь Одигитрия», «Николай Чудотворец» и «Сошествие Святого Духа». Главный престол был освящен в честь Сошествия Святого Духа, боковой придел — во имя святого Николая Чудотворца. Второй придел, Покровский, был пристроен к трапезной в 1769–1770 годах на средства богатой прихожанки Е. Л. Демидовой, принадлежавшей к семье известных заводчиков. Из первоначального убранства придела сохранилась икона Богоматери «Утоли моя печали».
Церковь почти не пострадала от пожара в 1812 году, но большинство домов в её приходе сгорели. На некоторое время храм был приписан к соседней церкви Григория Неокесарийского на Полянке, но вскоре он снова стал самостоятельным. Приход был невелик, однако среди прихожан преобладали представители купечества — семьи Медынцевых, Шестовых, а с 1851 года — Третьяковых, которые купили дом в Лаврушинском переулке, по соседству с храмом. Богатые прихожане дарили дорогую утварь и ценные облачения, заботились о благоустройстве храма.
Когда трапезная и колокольня пришли в ветхость, на их месте по проекту архитектора Ф. М. Шестакова в 1833–1834 годах построили новые — в стиле ампир. Стройная четырехъярусная колокольня возвышалась над окрестной малоэтажной застройкой и была видна издали. Вскоре церковный участок обнесли каменной оградой, а в 1836 году по проекту того же архитектора Шестакова построили рядом с храмом двухэтажную каменную богадельню.
Крупные работы в церкви были проведены в 1856–1858 годах на средства П. М. Третьякова и братьев Медынцевых. Алтарная часть храма была разобрана и построена заново, интерьер был украшен росписями и новым иконостасом, в котором разместили старинные иконы. П. М. Третьяков, основатель Третьяковской галереи, отличался благочестием и принимал деятельное участие в жизни храма.
Настоятелем церкви в 1855–1889 годах был протоиерей Василий Нечаев, получивший известность как проповедник и издатель основанного им православного журнала «Душеполезное чтение». Именно он в 1872 году отслужил молебен при закладке первого здания Третьяковской галереи. Впоследствии протоиерей В. Нечаев принял монашество с именем Виссарион и стал епископом Костромским. Его многолетним помощником был диакон Фёдор Соловьёв, который прослужил в Толмачах 28 лет. Он собрал сведения о храм и издал книгу «Московская Николаевская, в Толмачах, церковь». Позднее Соловьёв стал священником в Успенском соборе в Кремле, а затем принял монашеский постриг с именем Алексий и удалился в монастырь Зосимова пустынь, прославившись как строгий подвижник и духовный наставник. В 1994 году он был причислен к лику святых.
Протоиерей Илья Четверухин был настоятелем церкви в самое трудное время — с 1919 по 1929 год. Настоятелю удалось восстановить порядок в храме и наладить образцовое служение, его проповеди и духовные беседы привлекли новых прихожан. Среди них были представители московской интеллигенции — искусствовед В. Т. Георгиевский, филолог-славист В. В. Бородич и другие.
В 1929 году церковь в Толмачах была закрыта под предлогом расширения экспозиции Третьяковской галереи. Здание церкви стало использоваться для хранения живописи. Колокольню и пятиглавие разобрали, внутри устроили межэтажные перекрытия. В 1990 году рядом было построено новое здание хранилища, и храм начали реставрировать. Сначала в нем собирались разместить концертный зал, но с 1993 года в церкви вновь стали проводить богослужения. Реставрация храма продолжалась до 1997 года. Заново была возведена колокольня, восстановлено пятиглавие, воссозданы иконостасы и стенные росписи. Значительную часть церковного убранства составили экспонаты из собрания Третьяковской галереи. Иконы главного иконостаса происходят из двух разных храмов: иконы местного ряда — из церкви Николы в Толмачах, остальные — из разрушенной в советское время церкви святых Космы и Дамиана в Кадашах.
Благодаря тому, что церковь Николы в Толмачах является храмом-музеем, в неё перенесли почитаемые православные святыни из экспозиции и запасников Третьяковской галереи. С 1998 года в церкви хранится почитаемая чудотворная Владимирская икона Богоматери. На протяжении веков икона находилась в Успенском соборе, а с 1930 года была выставлена в Третьяковской галерее как всемирно известное произведение искусства. Икона помещена в специальную витрину, оформленную как киот, в которой создаются особые климатические условия. Также в боковом приделе установлено чудотворное Распятие из Успенского собора в Дмитрове.
